植物過氧化物酶POD活性測定試劑盒（微板法）
Plant Peroxidase Activity Assay Kit（Microplate Method） Ver.751165-2.0
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貨號
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名稱
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規(guī)格
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PD1050M
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植物過氧化物酶POD活性測定試劑盒（微板法）
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100次
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● 產(chǎn)品組成：
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組分貨號
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名稱
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規(guī)格
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貯存
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PD1050M-01
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提取緩沖液
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100 ml
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4℃
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PD1050M-02
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試劑1-顯色劑
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5 ml
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4℃，避光
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PD1050M-03
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試劑2-分析緩沖液
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20 ml
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4℃
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PD1050M-04
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試劑3-酶底物
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1.2 ml
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4℃，避光
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● 產(chǎn)品簡介：
過氧化物酶（Peroxidase，POD）是一種活性較高、廣泛存在于植物組織器官中的氧化還原酶，以鐵卟啉為輔基，能催化過氧化氫（H2O2）直接氧化酚類或胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用，有效防止過氧化氫在體內(nèi)的積累，從而對植物體起到保護(hù)作用；同時，過氧化物酶能使植物組織中所含的某些碳水化合物轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素,是細(xì)胞木質(zhì)素合成途徑中間的關(guān)鍵酶。所以，POD與植物體內(nèi)物質(zhì)代謝及抗逆性都有著密切關(guān)系。
測定原理：用愈創(chuàng)木酚（即鄰甲氧基酚，Guaiacol）為過氧化物酶的底物，在過氧化物酶催化下，過氧化氫可將愈創(chuàng)木酚氧化成紅棕色的4-鄰甲氧基苯酚，該物質(zhì)在470 nm處有最大吸收，故可通過測470 nm下吸光值變化測定過氧化物酶活性。
該試劑盒使用酶標(biāo)儀，用微孔板測定植物樣品中的POD活性，以每次提取使用1 ml提取液，200 μl反應(yīng)體系計算，該產(chǎn)品可以大約使用100次。
本試劑盒適用于檢測植物組織中的過氧化物酶(POD)活力，不推薦用于動物組織、動物細(xì)胞、細(xì)菌以及血清樣品中POD的檢測。
● 貯存、運輸及效期：
4℃貯存；常溫運輸；有效期一年。
● 自備材料：
植物材料；研缽；石英砂；聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）；酶標(biāo)儀（檢測波長470 nm）；低溫臺式離心機；可調(diào)式移液器；冰；蒸餾水。
● 實驗準(zhǔn)備：
1. 酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，設(shè)定波長到470 nm；
2. 測定前提前30 min取出試劑1、 試劑2和試劑3，平衡至常溫（25℃）；
3. 提前打開制冰機。
● 操作步驟：
建議正式實驗前，選取2個樣本做預(yù)測定，了解實驗樣品情況，熟悉流程，避免浪費樣本和試劑。
一. 樣本POD提取：
1.1 取新鮮植物組織，按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（ml）為~1：10的比例用研缽進(jìn)行冰浴研磨，制備成~10%植物勻漿液，如0.1 g 植物葉片，加入1 ml提取液，用研缽進(jìn)行冰浴研磨。
注：水分充足的樣品可以制成5%勻漿液（0.5 g：10 ml）；對于纖維含量多的植物如水稻葉片，可加入適量石英砂（試劑盒不提供，自備）輔助研磨，提高研磨效率；對于多糖多酚含量高的植物，可以在提取液中加入1% PVPP（試劑盒不提供，自備），能有效去除多糖多酚對活性測定的干擾。
1.2 12000 rpm，4℃離心10 min，取上清，即為含有POD的樣本，置冰上測定。
注：提取的樣本如需貯存，4℃貯存3天；建議按需分裝后-80℃貯存，兩周內(nèi)使用，盡量避免反復(fù)凍融；不建議-20℃貯存。
二. 樣本測定：
2.1 酶標(biāo)儀程序設(shè)置：
確定使用470
nm波長檢測；如果酶標(biāo)儀可以間隔采集吸光值，設(shè)定檢測程序每1 min讀數(shù)一次，設(shè)定多次讀數(shù)（一般可以設(shè)定5次，時間總長5 min）；如果酶標(biāo)儀無此功能，記錄初始吸光值和終止時間的吸光值。
2.2 在微孔板中依次加入：
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加入順序
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試劑名稱
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加入體積（μl）
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反應(yīng)總體積 200
μl
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1
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樣本
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x
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2
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試劑1-顯色劑
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40
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3
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試劑2-分析緩沖液
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150-x
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4
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試劑3-酶底物
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10
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混勻后，立即在 470 nm處讀取吸光值 A1以及每間隔1 min，5 min內(nèi)反應(yīng)時間后的吸光值A2，△A=A2-A1
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注1：由于計算公式用△A，計算的是A470讀數(shù)的差值，可以不做空白對照（不加樣本）。
注2：10%植物勻漿液x經(jīng)驗值一般為10-50
μl。
注3：若吸光值的上升趨勢不穩(wěn)定，可全部加完所有試劑后讀取5 min內(nèi)每間隔1 min的吸光值，根據(jù)時間對吸光值做線性回歸曲線，選取一段線性增長范圍讀取△A值（參見實驗示例）。
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2.3 由于植物樣本繁多，不同物種的POD活性差異很大，有的物種活性很高（反應(yīng)啟動后混合液顏色很快由橘黃色變?yōu)榧t褐色）；有的物種活性很低（反應(yīng)啟動后 5 分鐘內(nèi)混合液不變色，吸光值只有小數(shù)點后三位的變化）。強烈建議先取 2-3 個樣本做個預(yù)測定，如果反應(yīng)啟動后混合液顏色很快由橘黃色變成紅褐色，A1值大于0.6
或 A2 值大于1.5 或ΔA大于1，說明酶活性過高，可降低樣本量 x，也可將樣本用提取緩沖液稀釋后（稀釋倍數(shù)為D）重新檢測。如果 A1 值很小（＜0.05），且△A 很小（＜0.005，隨時間延長A470幾乎不變化），且反應(yīng)啟動后一段時間沒有顯色（一般5 min內(nèi)），說明酶活性很低，可增加樣本量x。
三. 活性計算：
3.1 按樣本鮮重（FW）計算：
3.1.1 酶活定義：每克植物組織鮮重（FW）每分鐘在200 μl反應(yīng)體系中使470 nm 處吸光值增加1為一個酶活力單位U。
注解：
△A：在時間T內(nèi)A470的增加值
FW（g）：樣本提取中使用植物材料的鮮重克數(shù)
T（min）：讀取兩次A470的間隔反應(yīng)時間
V總（ml）：樣本提取中加入提取液的總體積
V樣（ml）：微孔板中加入的樣本體積x μl，轉(zhuǎn)換為ml數(shù)
D= 樣本稀釋倍數(shù)，未稀釋為1
3.1.2 計算示例：
取0.5 克（FW=0.5）綠蘿葉片，加入5 ml提取液（V總=5）冰浴勻漿，制成10%勻漿液，12000 rpm 4℃離心10 min，取上清置于冰上，按照測定步驟操作，取10 μl樣本（V樣=0.01）測定，三個復(fù)孔，設(shè)定酶標(biāo)儀檢測波長470 nm，間隔1 min采集數(shù)據(jù)，采集10次；時間對吸光值做線性回歸曲線，4-6 min（T=2）線性較好，2 min內(nèi)△A=0.225-0.130=0.095。計算POD（U/g FW）=0.095/0.5×1/2×5/0.01×1=47.5 U/g FW
3.2 按樣本蛋白濃度計算：
3.2.1 注：此方法需要測定樣本的蛋白濃度，推薦使用BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號:RTP7102）。
酶活定義：每毫克蛋白（mg prot）每分鐘在200 μl反應(yīng)體系中使 470 nm 處吸光值增加1為一個酶活力單位 U。
注解：
△A：在時間T內(nèi)A470的增加值
V樣（ml）：酶促反應(yīng)中加入的樣本體積x μl，轉(zhuǎn)換為ml數(shù)
Cpr：樣本蛋白濃度（mg/ml）
T（min）：讀取兩次A470的間隔時間
D：樣本稀釋的倍數(shù)，未稀釋即為1
3.2.2 綠蘿POD活性測定-按樣本蛋白濃度計算：
取0.5 克綠蘿葉片，加入5 ml提取液冰浴勻漿，制成10%勻漿液，12000 rpm 4℃離心10 min，取上清置于冰上，BCA蛋白定量試劑盒（貨號：RTP7102）測定蛋白濃度為2 mg/ml（Cpr=2）；按照測定步驟操作，取10 μl樣本（V樣=0.01）測定，設(shè)定酶標(biāo)儀檢測波長470 nm，間隔1 min采集數(shù)據(jù)，采集5次；時間對吸光值做線性回歸曲線，0-5 min（T=5）線性較好，5 min內(nèi)△A=0.277-0.088=0.189。計算公式： POD（U/mg prot）=0.189/（0.01×2）×1/5×1=1.89 U/mg prot。